La découverte de nouvelles molécules d’intérêt thérapeutique contre un pathogène (bactéries, virus, parasites) nécessite de définir une cible (généralement une enzyme du pathogène) que l’on souhaite inhiber. Cette cible possède le plus souvent une enzyme équivalente chez l’homme qui, si elle est également inhibée, conduira à des effets indésirables (effets secondaires). Les molécules destinées à la lutte contre un pathogène doivent donc présenter une sélectivité et une spécificité extrêmement élevée.
Les transcétolases (TKT) sont des enzymes ubiquitaires impliquées dans une voie métabolique présente chez tous les organismes (voie des pentoses phosphates). Néanmoins les séquences protéiques des enzymes bactériennes, parasitaires et humaines différent grandement. Il est donc envisageable de pouvoir identifier un inhibiteur d’une enzyme d’un organisme pathogène qui n’ait pas d’effet chez l’homme. Les TKT cibles de ce projet seront issues de bactéries (Mycobacterium tuberculosis, Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus, Pseudomonas sp.) mais aussi de parasites (Trypanosoma gambiense, Plasmodium falciparum et Schistosoma mansoni).
Afin d’identifier des inhibiteurs spécifiques, il est nécessaire de recourir à une méthode de mesure des activités TKT qui soit rapide et sensible car les chimiothèques (collections de molécules) contiennent des milliers de molécules à tester. A l’issu d’un travail collaboratif entre l’ICCF (Institut de chimie de Clermont-Ferrand) et l’ICBMS (Institut de Chimie et Biochimie Moléculaire et Supramoléculaire, Lyon) (Projet ANR JCJC Transbioscreen), nous avons développé une telle méthode de criblage en utilisant une approche innovante basée sur l’électrochimie, les approches plus classiques (absorption UV-Vis, fluorescence) ne répondant pas aux exigences d’un crible. La méthode a été validée sur une TKT modèle de bactérie non pathogène (Escherichia coli) et a permis l’identification d’un nouvel inhibiteur.
Ce projet vise donc à appliquer cette méthodologie de criblage sur les différentes TKT d’organismes pathogènes et d’identifier des inhibiteurs spécifiques pour chacune d’entre elles. Pour cela, une dizaine de TKT seront produites en utilisant les méthodes usuelles de biologie moléculaire et de biochimie. La plupart de ces enzymes n’étant pas caractérisées, une étude cinétique complète sera réalisée afin d’adapter le crible existant à chacune d’entre elle. Enfin le criblage d’inhibiteurs sera réalisé sur l’ensemble de ces TKT mais aussi sur la TKT humaine afin d’identifier de possibles inhibitions croisées. Les molécules criblées seront en priorités des analogues structuraux de l’inhibiteur identifié à ce jour.
D’autre part, l’appareillage électrochimique utilisé actuellement étant de facture ancienne, non supporté et basé sur un traitement de données obsolète, la conception d’un nouveau prototype est nécessaire et a déjà été initiée par l’ICBMS en partenariat avec l’INL (Institut des Nanotechnologies de Lyon). Le principe de l’appareil est de pouvoir appliquer très rapidement (en moins de 1 minute) des impulsions de potentiel à 96 électrodes sérigraphiées et de mesurer les 96 intensités de courants correspondantes, mesures reliées ici à une activité TKT. Ce type d’appareillage étant inexistant sur le marché, la société Origalys, spécialiste local de la fabrication d’appareillages pour l’électrochimie, s’est proposée de contribuer à ce nouveau développement.
A l’issue du projet, une collection de TKT sera disponible pour des tests fonctionnels mais aussi pour de futures études structurales auprès de partenaires académiques locaux (Cristallographie aux rayons X). Des inhibiteurs auront été identifiés et l’étude de leur spécificité permettra d’envisager des tests sur des organismes pathogènes et la synthèse de nouvelles molécules sur la base des relations structures/activités observées. Une nouvelle génération d’appareillages électrochimiques au format 96 électrodes sera également disponible sous forme de prototype à l’ICBMS et à l’INL et sous forme de produit en développement au sein de la société Origalys.